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I vaccini a mRNA modificano il genoma umano. Ora lo dimostrano i primi studi

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Trascrizione inversa intracellulare del vaccino Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA BNT162b2 in vitro nella linea cellulare del fegato umano

di
Markus Aldén
1 ,
Francisko Olofsson Falla
1 ,
Daowei Yang
1 ,
Mohammad Barghouth
1 ,
Cheng Luan
1 ,
Magnus Rasmussen
2 e
Yang De Marini
1,*
1
Dipartimento di Scienze Cliniche, Università di Lund, 20502 Malmö, Svezia
2
Medicina delle infezioni, Dipartimento di Scienze Cliniche, Università di Lund, 22362 Lund, Svezia
*
Autore a cui indirizzare la corrispondenza.
Editore accademico: Stephen Malnick
Corr. Problemi Mol. Biol. 2022 , 44 (3), 1115-1126; https://doi.org/10.3390/cimb44030073 (registrazione DOI)
Ricevuto: 18 gennaio 2022 / Revisionato: 19 febbraio 2022 / Accettato: 23 febbraio 2022 / Pubblicato: 25 febbraio 2022
(Questo articolo appartiene all'argomento Ricerca clinica, traslazionale e di base sulle malattie del fegato )
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Studi preclinici sul vaccino mRNA COVID-19 BNT162b2, sviluppato da Pfizer e BioNTech, hanno mostrato effetti epatici reversibili negli animali che hanno ricevuto l'iniezione di BNT162b2. Inoltre, uno studio recente ha mostrato che l'RNA SARS-CoV-2 può essere trascritto inverso e integrato nel genoma delle cellule umane. In questo studio, abbiamo studiato l'effetto di BNT162b2 sulla linea cellulare di fegato umano Huh7 in vitro. Le cellule Huh7 sono state esposte a BNT162b2 e la PCR quantitativa è stata eseguita sull'RNA estratto dalle cellule. Abbiamo rilevato livelli elevati di BNT162b2 nelle cellule Huh7 e cambiamenti nell'espressione genica dell'elemento nucleare 1 lungo intervallato (LINE-1), che è una trascrittasi inversa endogena. L'immunoistochimica che utilizza il legame dell'anticorpo alla LINE-1 open reading frame-1 RNA-binding protein (ORFp1) su cellule Huh7 trattate con BNT162b2 ha indicato una maggiore distribuzione del nucleo di LINE-1. La PCR sul DNA genomico delle cellule Huh7 esposte a BNT162b2 ha amplificato la sequenza di DNA unica di BNT162b2. I nostri risultati indicano un rapido assorbimento di BNT162b2 nella linea cellulare del fegato umano Huh7, portando a cambiamenti nell'espressione e nella distribuzione della LINEA-1. Mostriamo anche che l'mRNA di BNT162b2 viene trascritto intracellularmente nel DNA in appena 6 h dopo l'esposizione a BNT162b2.
Parole chiave: Vaccino mRNA COVID-19 ; BNT162b2 ; fegato ; trascrizione inversa ; LINEA-1 ; Eh7

1. Introduzione

La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è stata annunciata dall'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) come pandemia globale l'11 marzo 2020 ed è emersa come una devastante crisi sanitaria . A febbraio 2022, COVID-19 ha portato a oltre 430 milioni di casi di infezione segnalati e 5,9 milioni di decessi in tutto il mondo [ 1 ]. Sono urgentemente necessari vaccini efficaci e sicuri per ridurre i tassi di morbilità e mortalità associati al COVID-19.
Sono stati sviluppati diversi vaccini per COVID-19, con particolare attenzione ai vaccini mRNA (di Pfizer-BioNTech e Moderna), ai vaccini vettoriali adenovirali ricombinanti difettosi per la replicazione (di Janssen-Johnson e Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V e CanSino ) e vaccini inattivati ​​(di Sinopharm, Bharat Biotech e Sinovac). Il vaccino mRNA presenta i vantaggi di essere flessibile ed efficiente nella progettazione e produzione di immunogeni e attualmente numerosi vaccini candidati sono in varie fasi di sviluppo e applicazione. In particolare, il vaccino mRNA COVID-19 BNT162b2 sviluppato da Pfizer e BioNTech è stato valutato in studi clinici di successo [ 2 , 3 , 4 ] e somministrato in campagne nazionali di vaccinazione COVID-19 in diverse regioni del mondo [ 5 , 6 , 7 , 8 ].
BNT162b2 è un vaccino a RNA (modRNA) incapsulato con nanoparticelle lipidiche (LNP) e codifica per l'intera lunghezza della proteina spike (S) SARS-CoV-2, modificata da due mutazioni della prolina per garantire una conformazione pre-fusione antigenicamente ottimale , che imita il virus intatto per suscitare anticorpi neutralizzanti il ​​virus [ 3 ]. Coerentemente con gli studi clinici randomizzati, BNT162b2 ha mostrato un'elevata efficienza in un'ampia gamma di esiti correlati a COVID-19 in un contesto del mondo reale [ 5 ]. Tuttavia, permangono molte sfide, incluso il monitoraggio della sicurezza e dell'efficacia a lungo termine del vaccino. Ciò garantisce ulteriori valutazioni e indagini. Il profilo di sicurezza di BNT162b2 è attualmente disponibile solo da studi clinici a breve termine. Sono stati segnalati effetti avversi meno comuni di BNT162b2, tra cui pericardite, aritmia, trombosi venosa profonda, embolia polmonare, infarto del miocardio, emorragia intracranica e trombocitopenia [ 4 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ]. Ci sono anche studi che riportano gli effetti avversi osservati in altri tipi di vaccini [ 21 , 22 , 23 , 24 ]. Per comprendere meglio i meccanismi alla base degli effetti avversi correlati al vaccino, sono necessarie indagini cliniche e analisi cellulari e molecolari.
Uno studio recente ha dimostrato che gli RNA SARS-CoV-2 possono essere trascritti e integrati nel genoma delle cellule umane [ 25 ]. Ciò fa sorgere la domanda se ciò possa verificarsi anche con BNT162b2, che codifica per l'RNA SARS-CoV-2 parziale. Nei dati di farmacocinetica forniti da Pfizer all'Agenzia europea per i medicinali (EMA), la biodistribuzione di BNT162b2 è stata studiata nei topi e nei ratti mediante iniezione intramuscolare con LNP radiomarcato e modRNA della luciferasi. La radioattività è stata rilevata nella maggior parte dei tessuti sin dal primo momento (0,25 h) ei risultati hanno mostrato che il sito di iniezione e il fegato erano i principali siti di distribuzione, con concentrazioni massime osservate a 8-48 h dopo la dose [ 26 ]. Inoltre, negli animali che hanno ricevuto l'iniezione di BNT162b2, sono stati osservati effetti epatici reversibili, tra cui ingrossamento del fegato, vacuolazione, aumento dei livelli di gamma glutamil transferasi (γGT) e aumento dei livelli di aspartato transaminasi (AST) e fosfatasi alcalina (ALP) [ 26 ]. In precedenza sono stati riportati effetti epatici transitori indotti dai sistemi di rilascio di LNP [ 27 , 28 , 29 , 30 ], tuttavia, è stato anche dimostrato che l'LNP vuoto senza modRNA da solo non introduce alcun danno epatico significativo [ 27 ]. Pertanto, in questo studio, miriamo a esaminare l'effetto di BNT162b2 su una linea cellulare di fegato umano in vitro e studiare se BNT162b2 può essere trascritto inversamente nel DNA attraverso meccanismi endogeni.

2. Materiali e metodi

2.1. Coltura cellulare

Le cellule Huh7 (JCRB Cell Bank, Osaka, Giappone) sono state coltivate a 37 ° C al 5% di CO 2 con terreno DMEM (HyClone, HYCLSH30243.01) integrato con siero bovino fetale al 10% ( v / v ) (Sigma-Aldrich, F7524 -500ML, Burlington, MA, USA) e 1% ( v / v ) di penicillina-streptomicina (HyClone, SV30010, Logan, UT, USA). Per il trattamento con BNT162b2, le cellule Huh7 sono state seminate con una densità di 200.000 cellule/pozzetto in piastre da 24 pozzetti. Il vaccino mRNA BNT162b2 (Pfizer BioNTech, New York, NY, USA) è stato diluito con iniezione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%, USP in una concentrazione finale di 100 μg/mL come descritto nelle linee guida del produttore [ 31 ]. La sospensione di BNT162b2 è stata quindi aggiunta in terreni di coltura cellulare per raggiungere concentrazioni finali di 0,5, 1,0 o 2,0 μg/mL. Le cellule Huh7 sono state incubate con o senza BNT162b2 per 6, 24 e 48 ore. Le cellule sono state lavate accuratamente con PBS e raccolte mediante tripsinizzazione e conservate a -80 ° C fino a un ulteriore utilizzo.

2.2. RT-QPCR IN TEMPO REALE

L'RNA dalle cellule è stato estratto con RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134, Hilden, Germania) seguendo il protocollo del produttore. La RT-PCR è stata eseguita utilizzando il kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA) seguendo il protocollo del produttore. La qPCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, USA) con primer per BNT162b2, LINE-1 e geni di pulizia ACTB e GAPDH ( Tabella 1 ).
Tabella 1. Sequenze di primer di RT-qPCR e PCR.
Tavolo

2.3. Immunofluorescenza e imaging confocale

Le cellule Huh7 sono state coltivate in vetrini a otto camere (LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, USA) con una densità di 40.000 cellule/pozzetto, con o senza BNT162b2 (0,5, 1 o 2 µg/mL) per 6 ore. L'immunoistochimica è stata eseguita utilizzando l'anticorpo monoclonale di topo anti-LINE-1 ORF1p primario (Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, USA), l'anticorpo secondario Cy3 Donkey anti-topo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) e Hoechst (Life tecnologie, 34850, Carlsbad, CA, USA), seguendo il protocollo di Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Sono state scattate due immagini per condizione utilizzando uno Zeiss LSM 800 e un obiettivo a immersione in olio 63X e l'intensità della colorazione è stata quantificata sull'intera area cellulare individuale e sull'area del nucleo su 15 cellule per immagine da ImageJ 1.53c. L'intensità della colorazione LINE-1 per il citosol è stata calcolata sottraendo l'intensità del nucleo da quella dell'intera cellula. A tutte le immagini delle cellule è stato assegnato un numero casuale per evitare pregiudizi. Per contrassegnare i nuclei (determinati dalla colorazione di Hoechst) e le cellule intere (determinate dai bordi della fluorescenza LINE-1), è stato utilizzato lo strumento di selezione a mano libera. Queste aree sono state quindi misurate e l'intensità media è stata utilizzata per confrontare i gruppi.

2.4. Purificazione del DNA genomico, amplificazione PCR, purificazione del gel di agarosio e sequenziamento di Sanger

Il DNA genomico è stato estratto da pellet cellulari con tampone PBND (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween-20) secondo il protocollo descritto in precedenza [ 32 ]. Per rimuovere l'RNA residuo dalla preparazione del DNA, RNasi (100 µ g/mL, Qiagen, Hilden, Germania) è stata aggiunta alla preparazione del DNA e incubata a 37 ° C per 3 ore, seguita da 5 minuti a 95 ° C. La PCR è stata quindi eseguita utilizzando primer mirati a BNT162b2 (le sequenze sono mostrate nella Tabella 1 ), con il seguente programma: 5 minuti a 95 ° C, 35 cicli di 95 ° C per 30 s, 58 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 minuto; infine, 72 °C per 5 min e 12 °C per 5 min. I prodotti della PCR sono stati eseguiti su p / v gel di agarosio Le bande corrispondenti agli ampliconi della dimensione prevista (444 bps) sono state tagliate e il DNA è stato estratto utilizzando il kit di purificazione PCR QIAquick (Qiagen, 28104, Hilden, Germania), seguendo le istruzioni del produttore. La sequenza dell'amplicone del DNA è stata verificata mediante sequenziamento di Sanger (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germania).

Statistiche

di Student a due code t e l'ANOVA. I dati sono espressi come media ± SEM o ± SD. Le differenze con p < 0,05 sono considerate significative.

2.5. Dichiarazioni etiche

La linea cellulare Huh7 è stata ottenuta dalla banca cellulare giapponese Collection of Research Bioresources (JCRB).

3. Risultati

3.1. BNT162b2 entra nelle cellule Huh7 della linea cellulare del fegato umano ad alta efficienza

Per determinare se BNT162b2 entra nelle cellule epatiche umane, abbiamo esposto la linea cellulare epatica umana Huh7 a BNT162b2. In uno studio precedente sulla cinetica di assorbimento dell'LNP nelle cellule Huh7, la massima efficacia biologica dell'LNP è stata osservata tra 4 e 7 ore [ 33 ]. Pertanto, nel nostro studio, le cellule Huh7 sono state coltivate con o senza concentrazioni crescenti di BNT162b2 (0,5, 1,0 e 2,0 µ g/mL) per 6, 24 e 48 ore. L'RNA è stato estratto dalle cellule ed è stata eseguita una reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) utilizzando primer mirati alla sequenza BNT162b2, come illustrato nella Figura 1 . La sequenza completa di BNT162b2 è disponibile pubblicamente [ 34 ] e contiene un cappuccio a due nucleotidi; 5′- regione non tradotta (UTR) che incorpora il 5′-UTR di un gene umano per l'α-globina; l'intera lunghezza della proteina SARS-CoV-2 S con due mutazioni della prolina; 3′-UTR che incorpora il segmento mitocondriale umano 12S rRNA (mtRNR1) e il segmento del gene AES/TLE5 umano con due mutazioni C→U; coda poli(A). L'analisi dettagliata della sequenza della proteina S in BNT162b2 ha rivelato 124 sequenze identiche al 100% alle sequenze genomiche umane e tre sequenze con un solo disadattamento di nucleotide (nt) in 19-26 nts ( Tabella S1, vedere Materiali supplementari ). Per rilevare il livello di RNA di BNT162b2, abbiamo progettato primer con primer forward situato nelle regioni della proteina SARS-CoV-2 S e primer inverso in 3′-UTR, che consente il rilevamento dell'amplicone PCR unico per BNT162b2 senza legame non specifico dei primer alle regioni genomiche umane .
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Figura 1. Set di primer per PCR utilizzato per rilevare il livello di mRNA e la trascrizione inversa di BNT162b2. L'illustrazione di BNT162b2 è stata adattata dalla letteratura precedentemente descritta [ 34 ].
I risultati di RT-qPCR hanno mostrato che le cellule Huh7 trattate con BNT162b2 avevano livelli elevati di mRNA di BNT162b2 rispetto ai geni di pulizia a 6, 24 e 48 ore ( Figura 2 , presentata in 2 -ΔΔCT loggati a causa di livelli eccezionalmente alti). Le tre concentrazioni di BNT162b2 hanno portato a livelli di mRNA di BNT162b2 intracellulari simili in diversi momenti, tranne per il fatto che la differenza significativa tra 1,0 e 2,0 µ g/mL è stata osservata a 48 ore. I livelli di mRNA di BNT162b2 sono stati significativamente ridotti a 24 ore rispetto a 6 ore, ma sono aumentati di nuovo a 48 ore.
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Figura 2. Livelli di mRNA di BNT162b2 nelle cellule Huh7 trattate con BNT162b2. Le cellule Huh7 sono state trattate senza (Ctrl) o con 0,5 (V1), 1 (V2) e 2 µg/mL (V3) di BNT162b2 per 6 (punti verdi), 24 (punti arancioni) e 48 ore (punti blu) . L'RNA è stato purificato e la qPCR è stata eseguita utilizzando primer mirati a BNT162b2. I livelli di RNA di BNT162b2 sono presentati come valori registrati di 2 −ΔΔCT relativi ai geni di mantenimento GAPDH e ACTB . I risultati provengono da cinque esperimenti indipendenti ( n = 5). di Student a due code t . I dati sono espressi come media ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 rispetto al rispettivo controllo in ogni momento, o come indicato).

3.2. Effetto di BNT162b2 sulla trascrittasi inversa endogena umana elemento nucleare-1 lungo intervallato (LINE-1)

Qui abbiamo esaminato l'effetto di BNT162b2 sull'espressione LINE-1 . La RT-qPCR è stata eseguita su RNA purificato da cellule Huh7 trattate con BNT162b2 (0, 0,5, 1,0 e 2,0 µg/mL) per 6, 24 e 48 ore, utilizzando primer mirati a LINE-1 . significativamente aumentata LINE-1 rispetto al controllo è stata osservata a 6 ore di 2,0 µg/mL di BNT162b2, mentre le concentrazioni di BNT162b2 inferiori hanno ridotto LINE-1 in tutti i punti temporali ( Figura 3 ).
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Figura 3. LINE-1 nelle cellule Huh7 trattate con BNT162b2. Le cellule Huh7 sono state trattate senza (Ctrl) o con 0,5 (V1), 1 (V2) e 2 µg/mL (V3) di BNT162b2 per 6 (punti verdi), 24 (punti rossi) e 48 ore (punti blu) . RNA è stato purificato e la qPCR è stata eseguita utilizzando primer mirati a LINE-1 . I livelli di RNA di LINE-1 sono presentati come valori di 2 −ΔΔCT relativi ai geni di mantenimento GAPDH e ACTB . I risultati provengono da cinque esperimenti indipendenti ( n = 5). di Student a due code t . I dati sono espressi come media ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 rispetto al rispettivo controllo in ogni momento, o come indicato; † p < 0,05 vs. 6 h-Ctrl).
Successivamente, abbiamo studiato l'effetto di BNT162b2 sul livello di proteina LINE-1. La LINE-1 a lunghezza intera è costituita da una regione non tradotta (UTR) di 5′, due frame di lettura aperti (ORF), ORF1 e ORF2 e una UTR 3′, di cui ORF1 è una proteina legante l'RNA con attività chaperone. È stato dimostrato che l'attività di retrotrasposizione di LINE-1 coinvolge la traslocazione di ORF1 nel nucleo [ 35 ]. Le cellule Huh7 trattate con o senza BNT162b2 (0,5, 1,0 e 2,0 µg/mL) per 6 ore sono state fissate e colorate con anticorpi che si legano a LINE-1 ORF1p e sonda specifica del DNA Hoechst per la visualizzazione del nucleo cellulare ( Figura ). La quantificazione dell'intensità della colorazione dell'immunofluorescenza ha mostrato che BNT162b2 ha aumentato i livelli di proteina LINE-1 ORF1p sia nell'intera area cellulare che nel nucleo a tutte le concentrazioni testate ( Figura 4 b-d).
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Figura 4. Immunoistochimica delle cellule Huh7 trattate con BNT162b2 sulla distribuzione della proteina LINE-1. Le cellule Huh7 sono state trattate senza (Ctrl) o con 0,5, 1 e 2 µg/mL di BNT162b2 per 6 ore. Le cellule sono state fissate e colorate con anticorpi che si legano a LINE-1 ORF1p (rosso) e sonda specifica del DNA Hoechst per la visualizzazione del nucleo cellulare (blu). ( a ) Immagini rappresentative dell'espressione di LINE-1 in cellule Huh7 trattate con o senza BNT162b2. ( b – d ) Quantificazione della proteina LINE-1 nell'intera area cellulare ( b ), nel citosol ( c ) e nel nucleo ( d ). Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando One-Way ANOVA e i grafici sono stati creati utilizzando GraphPad Prism V 9.2. Tutti i dati sono presentati come media ± DS (** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 come indicato).

3.3. Rilevamento del DNA BNT162b2 trascritto inverso nelle cellule Huh7

Uno studio precedente ha dimostrato che l'ingresso della proteina LINE-1 nel nucleo è associato alla retrotrasposizione [ 35 ]. Nell'esperimento di colorazione con immunofluorescenza sopra descritto, sono stati osservati livelli aumentati di LINE-1 nel nucleo già alla concentrazione più bassa di BNT162b2 (0,5 µ g/mL). Per esaminare se BNT162b2 viene trascritto inversamente nel DNA quando LINE-1 è elevato, abbiamo purificato il DNA genomico da cellule Huh7 trattate con 0,5 µ g/mL di BNT162b2 per 6, 24 e 48 h. Il DNA purificato è stato trattato con RNasi per rimuovere l'RNA e sottoposto a PCR utilizzando primer mirati a BNT162b2, come illustrato nella Figura 1 . I frammenti di DNA amplificati sono stati quindi visualizzati mediante elettroforesi e purificati con gel ( Figura 5 ). Gli ampliconi del DNA BNT162b2 sono stati rilevati in tutti e tre i punti temporali (6, 24 e 48 ore). Il sequenziamento di Sanger ha confermato che gli ampliconi del DNA erano identici alla sequenza BNT162b2 affiancata dai primer ( Tabella 2 ). Per garantire che gli ampliconi del DNA fossero derivati ​​​​dal DNA ma non dall'RNA BNT162b2, abbiamo anche eseguito la PCR su RNA purificato da cellule Huh7 trattate con 0,5 µ g/mL di BNT162b2 per 6 ore, con o senza trattamento con RNasi (Ctrl 5 e 6 in Figura 5 ), ​​e nessun amplicone è stato rilevato nei campioni di RNA sottoposti a PCR.
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Figura 5. Rilevazione di ampliconi di DNA di BNT162b2 in cellule Huh7 trattate con BNT162b2. Le cellule Huh7 sono state trattate senza (Ctrl) o con 0,5 µg/mL di BNT162b2 per 6, 24 e 48 ore. Il DNA genomico è stato purificato e digerito con 100 µg/mL di RNasi. La PCR è stata eseguita su tutti i campioni con primer rivolti a BNT162b2, come mostrato nella Figura 1 e Tabella 1 . Gli ampliconi del DNA (444 bps) sono stati visualizzati su gel di agarosio. BNT: BNT162b2; L: scala del DNA; Ctrl1: cellule Huh7 in coltura; Ctrl2: cellule Huh7 senza trattamento BNT162b2 raccolte a 6 h; Ctrl3: cellule Huh7 senza trattamento BNT162b2 raccolte a 24 ore; Ctrl4: cellule Huh7 senza trattamento BNT162b2 raccolte a 48 h; Ctrl5: RNA da cellule Huh7 trattate con 0,5 µ g/mL di BNT162b2 per 6 h; Ctrl6: RNA da cellule Huh7 trattate con 0,5 µ g/mL di BNT162b2 per 6 ore, digerite con RNasi.
Tavolo 2. Risultato del sequenziamento di Sanger dell'amplicone BNT162b2.
Tavolo

4. Discussione

In questo studio presentiamo prove che il vaccino BNT162b2 dell'mRNA COVID-19 è in grado di entrare nella linea cellulare del fegato umano Huh7 in vitro. L'mRNA di BNT162b2 viene trascritto inversamente a livello intracellulare nel DNA fino a 6 ore dopo l'esposizione a BNT162b2. Un possibile meccanismo per la trascrizione inversa è attraverso la trascrittasi inversa endogena LINE-1 e la distribuzione della proteina del nucleo di LINE-1 è elevata da BNT162b2.
L'accumulo intracellulare di LNP negli epatociti è stato dimostrato in vivo [ 36 ]. Uno studio preclinico su BNT162b2 ha mostrato che BNT162b2 entra nelle cellule HEK293T della linea cellulare umana e porta a un'espressione robusta dell'antigene BNT162b2 [ 37 ]. Pertanto, in questo studio, abbiamo prima studiato l'ingresso di BNT162b2 nelle cellule Huh7 della linea cellulare del fegato umano. La scelta delle concentrazioni di BNT162b2 utilizzate in questo studio merita una spiegazione. BNT162b2 viene somministrato come una serie di due dosi a tre settimane di distanza e ciascuna dose contiene 30 µg di BNT162b2 in un volume di 0,3 mL, il che rende la concentrazione locale nel sito di iniezione al massimo di 100 µg/mL [ 31 ]. Uno studio precedente sui vaccini mRNA contro i virus dell'influenza H10N8 e H7N9 utilizzando un sistema di rilascio LNP simile ha mostrato che il vaccino mRNA può distribuirsi in modo piuttosto aspecifico a diversi organi come fegato, milza, cuore, rene, polmone e cervello e la concentrazione nel il fegato è circa 100 volte inferiore a quello del sito di iniezione intramuscolare [ 38 ]. Nel rapporto di valutazione su BNT162b2 fornito all'EMA da Pfizer, gli studi di distribuzione farmacocinetica nei ratti hanno dimostrato che una proporzione relativamente ampia (fino al 18%) della dose totale si distribuisce al fegato [ 26 ]. Abbiamo quindi scelto di utilizzare 0,5, 1 e 2 μg/mL di vaccino nei nostri esperimenti sulle cellule del fegato. Tuttavia, l'effetto di una gamma più ampia di concentrazioni sempre più basse di BNT162b2 dovrebbe essere verificato anche in studi futuri.
Nel presente studio, abbiamo impiegato una linea cellulare di fegato umano per l'indagine in vitro. Vale la pena indagare se le cellule del fegato presentano anche la proteina spike SARS-CoV-2 derivata dal vaccino, che potrebbe potenzialmente rendere le cellule del fegato bersagli per cellule T citotossiche reattive della proteina spike precedentemente innescate. Sono stati segnalati casi su individui che hanno sviluppato epatite autoimmune [ 39 ] dopo la vaccinazione con BNT162b2. Per ottenere una migliore comprensione dei potenziali effetti di BNT162b2 sulla funzione epatica, sono desiderati modelli in vivo per studi futuri.
Nel rapporto sulla tossicità di BNT162b2, non sono stati forniti studi di genotossicità o cancerogenicità [ 26 ]. Il nostro studio mostra che BNT162b2 può essere trascritto inversamente al DNA nella linea cellulare del fegato Huh7, e questo può dare adito alla preoccupazione se il DNA derivato da BNT162b2 possa essere integrato nel genoma dell'ospite e influenzare l'integrità del DNA genomico, che può potenzialmente mediare genotossicità effetti collaterali. In questa fase, non sappiamo se il DNA trascritto inverso da BNT162b2 sia integrato nel genoma cellulare. Sono necessari ulteriori studi per dimostrare l'effetto di BNT162b2 sull'integrità genomica, compreso il sequenziamento dell'intero genoma delle cellule esposte a BNT162b2, nonché i tessuti di soggetti umani che hanno ricevuto la vaccinazione BNT162b2.
Il retrotrasposone autonomo umano LINE-1 è una trascrittasi inversa endogena cellulare e l'unico trasposone attivo rimasto nell'uomo, in grado di retrotrasporre se stesso e altri elementi non autonomi [ 40 , 41 ] e circa il 17% del genoma umano è composto da sequenze LINE-1 [ 42 ]. Gli Alu , gli elementi nucleotidici brevi e intervallati (SINE), il numero variabile di ripetizioni in tandem (VNTR), nonché gli pseudogeni cellulari elaborati con mRNA, sono retrotrasposti dalle proteine ​​​​di retrotrasposizione LINE-1 che lavorano in trans [ 43 , 44 ]. Uno studio recente ha dimostrato che la LINE-1 endogena media la trascrizione inversa e l'integrazione delle sequenze SARS-CoV-2 nei genomi delle cellule umane infette [ 25 ]. Inoltre, l'espressione della LINE-1 endogena è spesso aumentata in caso di infezione virale, inclusa l'infezione da SARS-CoV-2 [ 45 , 46 , 47 ]. Precedenti studi hanno dimostrato che l'attività di retrotrasposizione della LINE-1 è regolata dal metabolismo dell'RNA [ 48 , 49 ], dalla risposta al danno del DNA [ 50 ] e dall'autofagia [ 51 ]. La retrotrasposizione efficiente della LINEA-1 è spesso associata al ciclo cellulare e alla rottura dell'involucro nucleare durante la mitosi. 52 , 53 ], nonché retrovirus esogeni [ 54 , 55 ], che promuovono l'ingresso della LINE-1 nel nucleo. Nel nostro studio, abbiamo osservato una maggiore distribuzione di LINE-1 ORF1p determinata dall'immunoistochimica nel nucleo da BNT162b2 a tutte le concentrazioni testate (0,5, 1 e 2 μg/mL), mentre un'elevata di LINE-1 espressione genica concentrazione (2 μg/mL). Vale la pena notare che la trascrizione genica è regolata dalle modificazioni della cromatina, dalla regolazione del fattore di trascrizione e dalla velocità di degradazione dell'RNA, mentre la regolazione traslazionale della proteina implica il reclutamento di ribosomi sul codone di inizio, la modulazione dell'allungamento del peptide, la fine della sintesi proteica o la biogenesi del ribosoma . Questi due processi sono controllati da meccanismi diversi e pertanto potrebbero non mostrare sempre gli stessi modelli di cambiamento in risposta a sfide esterne. L'esatta regolazione dell'attività LINE-1 in risposta a BNT162b2 merita ulteriori studi.
Il modello cellulare che abbiamo utilizzato in questo studio è una linea cellulare di carcinoma, con replicazione attiva del DNA che differisce dalle cellule somatiche non in divisione. È stato anche dimostrato che le cellule Huh7 mostrano un'espressione genica e proteica significativa e diversa, comprese le proteine ​​sovraregolate coinvolte nel metabolismo dell'RNA [ 56 ]. Tuttavia, la proliferazione cellulare è attiva anche in diversi tessuti umani come il midollo osseo o gli strati basali degli epiteli, nonché durante l'embriogenesi, ed è quindi necessario esaminare l'effetto di BNT162b2 sull'integrità genomica in tali condizioni. Inoltre, un'efficace retrotrasposizione di LINE-1 è stata riportata anche in cellule non in divisione e differenziate in modo terminale, come i neuroni umani [ 57 , 58 ].
Il rapporto di valutazione Pfizer EMA ha anche mostrato che BNT162b2 si distribuisce nella milza (<1,1%), nelle ghiandole surrenali (<0,1%), così come una radioattività bassa e misurabile nelle ovaie e nei testicoli (<0,1%) [ 26 ]. Inoltre, dal rapporto di valutazione Pfizer EMA non sono disponibili dati sul trasferimento placentare di BNT162b2. I nostri risultati hanno mostrato che l'mRNA di BNT162b2 entra prontamente nelle cellule Huh7 a una concentrazione (0,5 µg/mL) corrispondente allo 0,5% della concentrazione del sito di iniezione locale, induce cambiamenti nel gene LINE-1 e nell'espressione proteica e, entro 6 ore, trascrizione inversa di BNT162b2 può essere rilevato. È quindi importante studiare ulteriormente l'effetto di BNT162b2 su altri tipi di cellule e tessuti sia in vitro che in vivo.

5. Conclusioni

Il nostro studio è il primo studio in vitro sull'effetto del vaccino mRNA COVID-19 BNT162b2 sulla linea cellulare del fegato umano. Presentiamo prove sull'ingresso rapido di BNT162b2 nelle cellule e sulla successiva trascrizione inversa intracellulare dell'mRNA di BNT162b2 nel DNA.

Materiali supplementari

È possibile scaricare le seguenti informazioni di supporto all'indirizzo: https://www.mdpi.com/article/10.3390/cimb44030073/s1 .

Contributi dell'autore

MA, FOF, DY, MB e CL hanno eseguito esperimenti in vitro. MA e FOF hanno eseguito l'analisi dei dati. MR e YDM hanno contribuito all'attuazione della ricerca, progettato e supervisionato lo studio. YDM ha scritto il documento con il contributo di tutti gli autori. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento

Questo studio è stato sostenuto dallo Swedish Research Council, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, dal Fondo del governo svedese per la ricerca clinica (ALF) e dalla fondazione dello Skåne University Hospital.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale

Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato

Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati

Tutti i dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili nell'articolo e nelle informazioni di supporto .

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Sven Haidl, Maria Josephson, Enming Zhang, Jia-Yi Li, Caroline Haikal e Pradeep Bompada per il loro supporto a questo studio.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

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